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        SMART快速構建系統

        服務內容:

        一、注冊登錄

        1. 登錄SMART載體快速構建系統地址:http://49.234.53.21/login  僅PC端使用);

        2. 點擊登錄框新用戶注冊,填寫紅色*必填項,點擊注冊即完成注冊。

        二、訂單預填

        1. 進入“我的訂單”,點擊右側的“新增”按鈕,進入新增訂單界面。在此界面可以查詢所有快構載體信息、訂單預填或者提交訂單。

        2. 在“載體名稱”處選擇目標載體(支持模糊查詢:隨著輸入字符的增加,縮小待選范圍)。比如需要將目標片段構建到pEGFP-N1載體的HindIII/ApaI酶切位點之間??梢灾惠斎雃gfp,然后在下拉框選擇填入“AK162-pEGFP-N1-120元”。

        3. 也可以精確輸入載體名稱,然后選擇填入“載體名稱”框,通過右側的綠色按鈕“查看載體詳情”進入轉導生物官網查看相應載體的全序列和圖譜。第一次使用某載體時,一定要仔細查看相應信息,并確定是否為目標載體。

        4. 注意此載體有兩個不同的編號【代表此載體有兩處常用構建位置(有個別載體甚至有3個以上的常用位置)】,可以首先選擇其中一個填入。

        5. 盡管此編號載體“上游位點”有HindIII位點,但是“下游位點”的下拉框里面沒有ApaI位點選擇。這種情況可以繼續查看此載體是否有另外編號。如果仍然沒有其他編號含有目標酶切位點,請更改方案或者選擇另外的酶切位點。

        6. 下拉框選擇填入“AK162-pEGFP-N1-120元”,然后在“上游位點”選擇填入HindIII位點,在“下游位點”選擇填入ApaI位點。

        7. 在“樣品名稱”里輸入5個字符(為了避免和其他客戶樣品混淆,字母和數字組合使用),并將此名稱命名在寄送的已純化的PCR產物管子上。

        8. 在“插入片段”里填入預估的插入片段DNA堿基數。

        9. “是否已經純化”:是:強烈建議提供已經電泳切膠純化后的、不低于20ul的含指定同源臂的PCR產物(未純化的樣品在運輸和后續操作過程中有可能出現降解等意外情況)。否:提供含同源臂的PCR原液100ul或電泳切膠后含單一目標條帶的膠塊,另收10元/樣的純化費。

        10. “陽性克隆數”:客戶提交訂單時可以填寫一次性測序多少個陽性克隆,轉導生物也會根據實際提供的陽性克隆數進行更改。

        11. “插入片段序列”: 在轉導測序的訂單需要粘貼待插入的整個目標序列(連同預計的同源臂及兩端額外5-10個堿基),用于測序結果分析比對;在第三方測序的,可以不黏貼序列,隨便輸入一個字符代替。粘貼

        12. 點擊右下方的“保存”按鈕。此訂單的相應數據將作為草稿保存。如果后續需要修改此訂單,可以點擊“編輯”進行更改。

        三、準備待構建的PCR片段

        1. 設計引物、合成后用于擴增目標DNA片段:

        A. 登錄系統,在“我的訂單”頁面找到相應訂單。點擊目標訂單最右側的“查看”按鈕。

        B.在“上游位點”框里復制正向引物的同源臂序列,在“下游位點”框里復制反向引物的同源臂序列,。


        C.將上游位點的同源臂序列直接粘貼在正向擴增引物的5’端。將下游位點的同源臂序列直接黏貼(無需再次反向互補)在反向擴增引物的5’端。

             如下:AB001F:CGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTNNNNNNNNNNNNNNNNN

                      AB001R: GGTGGCGACCGGTGGATCCCGGGCCCNNNNNNNNNNNNNNNNN

                      N代表用于特異擴增的特異引物序列。

        D.含有指定同源臂序列的引物合成后,盡量使用優質的高保真酶擴增目標片段(為了減小堿基突變概率,盡量不用含有Taq酶的PCR酶)。

        E.瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物,并切膠目標條帶后進行純化回收。如果條帶比較弱,建議多做幾個體系的PCR產物,純化回收時用少量水反復過柱濃縮。

        2. 已經純化好的PCR樣品準備好后,通知收樣員收樣

        3. 在“我的訂單”向右橫向拖拉直至看到“代理/收樣員”。直接電話聯系收樣員(沒有收樣員的地區請低溫快遞至指定地址,拒絕到付件)。

        四、構建及測序

        1. 樣品送出后,在“我的訂單”頁面找到相應訂單,點擊目標訂單最右側的“編輯”按鈕,提交處于保存狀態的訂單。(注意:A.如果是新客戶,客戶信息在還沒有通過審核的情況下,訂單提交功能還沒有開通,請及時聯系轉導生物工作人員;B.一旦提交訂單,客戶將不能修改此訂單,如果需要修改調整,請通過官方QQ4000275066聯系工作人員)。

        2. 轉導生物在收到樣品的2個工作日內完成克隆構建實驗,并進入下游的測序環節。

        3. 在轉導測序的訂單:提供陽性克隆甘油菌一份+小提保種質粒一份,收基礎構建費用+40元/測序反應+特異測序引物合成費用(5毛/堿基);轉導生物還負責測序數據的整理、比對和結果展示。

        4. 指定第三方公司(武漢奧科鼎盛)測序的訂單:僅提供陽性克隆甘油菌一份,收基礎構建費用+10元/測序反應+特異測序引物合成費用(5毛/堿基);構建成功后,直接交由第三方測序公司完成1個通用引物測序,并發送至客戶郵箱,客戶審視結果后,如需加測請客戶自行郵件溝通;根據實測反應數(10元/反應)和加測引物堿基數(0.5元/bp),轉導直接收取相應費用,客戶不需要向第三方測序公司支付。

        五、結算和交付

        1. 測序完成后,客戶審視實驗結果。確定無誤后,轉導生物根據實際測序反應數和加測引物堿基數(通過訂單詳情頁可查看),再次核算結算金額并核銷收取相應費用。

        2. 結算完成,請通過官方QQ400027506通知交付相應的陽性克隆甘油菌1ml(轉導測序的訂單還另含對應的一份小提質粒)。

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